CRISPR-Cas9是近年來(lái)興起的基因組編輯工具，已被應(yīng)用在水稻、玉米和擬南芥等二倍體植物中構(gòu)建靶向敲除突變體庫(kù)，但應(yīng)用到四倍體作物中還鮮有報(bào)道。異源四倍體甘藍(lán)型油菜（Brassica napus,AACC,2n=38）是我國(guó)第一大油料作物，利用CRISPR-Cas9對(duì)其復(fù)雜基因組進(jìn)行高通量靶向突變，將為具優(yōu)異性狀的新種質(zhì)的高通量創(chuàng)建、重要新基因的批量挖掘、乃至油菜分子設(shè)計(jì)育種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
在本文中，作者首先設(shè)計(jì)了18414個(gè)sgRNA以用于靶向10480個(gè)與油菜生殖器官發(fā)育和種子形成等相關(guān)基因。將該混合的CRISPR-Cas9表達(dá)文庫(kù)遺傳轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜獲得1104個(gè)轉(zhuǎn)基因再生株系。測(cè)序分析結(jié)果表明，所檢測(cè)的178個(gè)靶基因里有93個(gè)發(fā)生了靶點(diǎn)編輯，即評(píng)估的靶點(diǎn)編輯效率為52.2%。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)sgRNA同時(shí)靶向多個(gè)油菜基因同源拷貝時(shí)，Cas9蛋白傾向于切割所有的拷貝從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的編輯。同時(shí)，作者利用已檢測(cè)過(guò)靶點(diǎn)編輯情況的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)多種重要表型進(jìn)行了反向遺傳學(xué)篩選，驗(yàn)證了該突變體庫(kù)高通量篩選特征及部分基因的功能；并進(jìn)一步通過(guò)正向遺傳學(xué)篩選挖掘到系列控制種子含油量或脂肪酸組分等重要農(nóng)藝性狀的新基因，這些基因的編輯可明顯改變種子的含油量或脂肪酸組分。
該工作為甘藍(lán)型油菜基因功能的高通量研究提供了寶貴種質(zhì)資源，所發(fā)掘的系列調(diào)控含油量等重要農(nóng)藝性狀的新基因，為油菜重要農(nóng)藝性狀的分子改良提供了有價(jià)值的基因資源。同時(shí)，該研究也為其它多倍體植物開(kāi)展高通量的靶向突變提供了一個(gè)有益的借鑒。
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張椿雨教授和華中科技大學(xué)栗茂騰教授為論文共同通訊作者，博士生何堅(jiān)杰及張凱博士為共同第一作者，博士生閆書祥、碩士生唐蜜和周惟賢、尹永泰博士和陳康博士也參與了此項(xiàng)研究。本研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“油菜和花生重要基因資源挖掘與利用”（2022YFD1200402）和國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(32272067和32072098)的資助。
審核人：張椿雨
論文鏈接：
https://genome.cshlp.org/content/early/2023/05/30/gr.277650.123.full.pdf+html
2023年6月10日
來(lái)源：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
